ICS 67.050
X 04
中華人民共和國國家標準
GB/T 18979-2003
食品中黃曲霉毒素的測定
免疫親和層析凈化液相色譜法
和 熒 光 光 度 法
De te r m in at io n a fla to xins content
Cleanup by immunoaffinity chromatogaphy
in foodand
determination by
high-performance liquid chromatigraphy and fluorometer
2003-02-21發(fā)布2003-08-01實施
雄 宙嘉 k Wi A * 1 M 發(fā)布
GB/T 18979-2003
月明青
本標準由北京市質量技術監(jiān)督局提出。
本標準由全國食品工業(yè)標準化技術委員會歸口。
本標準起草單位:北京市產品質量監(jiān)督檢驗所、青島出人境檢驗檢疫局、國家標準物質研究中心。
本標準主要起草人:王晶、張鵬、張藝兵、邵明武。
本標準為發(fā)布。
GB/T 18979-2003
食 品 中黃 曲霉毒素的測定
免疫親和層析凈化液相色譜法
和 熒 光 光 度 法
范圍
本 標 準 規(guī)定了免疫親和層析凈化一液相色譜法和免疫親和層析凈化一熒光光度法測定食品中
黃曲霉毒素的條件和詳細分析步驟。
本 標 準 適用于玉米、花生及其制品(花生醬、花生仁、花生米)、大米、小麥、植物油脂、醬油、食醋等食
品中黃曲霉毒素的測定。
樣 品 中 黃曲霉毒素的檢出限:免疫親和層析凈化一液相色譜法測定黃曲霉毒素B;以及黃曲霉
毒素B,,玖,G,,G ?？偭繖z出限為 1k g/kg。免疫親和層析凈化一熒光光度法測定黃曲霉毒素B氏、
G,,G 總量檢出限為 1m g/kg,醬油樣品中檢出限為2.5 p g/kg.
2 免疫親和層析凈化液相色譜法
2.1 方法提要
試 樣 經 過甲醇一水提取，提取液經過濾、稀釋后，濾液經過含有黃曲霉毒素特異抗體的免疫親和層析
凈化，此抗體對黃曲霉毒素BBz,GG:具有專一性，黃曲霉毒素交聯在層析介質中的抗體上。用水
或吐溫-20/PBS將免疫親和柱上雜質除去，以甲醇通過免疫親和層析柱洗脫，洗脫液通過帶熒光檢測器
的液相色譜儀柱后碘溶液衍生測定黃曲霉毒素的含量。
2.2 試劑和溶液
除非 另 有規(guī)定，僅使用分析純試劑、重蒸餾水。
2.2.1 甲醇(CH,OH):色譜純。
2.2.2 甲醇一水(7+3):取70 mL甲醇加30 mL水。
2.2.3 甲醇一水(8+2):取80 mL甲醇加20 mL水。
2.2.4 甲醇一水(45+55):取45 mL甲醇加55 mL水。
2.2.5 苯:色譜純。
2.2.6 乙睛:色譜純。
2.2.7 苯一乙睛(98+2):取2 mL乙睛加98 mL苯。
2.2.8 抓化鈉(NaCI),
2.2.9 磷酸氫二鈉(NaiH PO,),
2.2. 10 磷酸二氫鉀(KHzP04).
2.2. 11 氯化鉀(KCl) e
2.2 .1 2 PBS緩沖溶液:稱取 8.0 g氯化鈉，1.2 g磷酸氫二鈉，0.2 g 磷酸二氫鉀，0.2 g 抓化鉀，用
990 mL純水溶解，然后用濃鹽酸調節(jié)pH值至7.0，zui后用純水稀釋至1 000 ML.
2.2.1 3 吐溫-20/PBS溶液(0.1 00):取 1m l一吐溫-20，加人 PBS緩沖溶液并定容至 10 00m L,
2.2.1 4 pH7.0磷酸鹽緩沖溶液:取 25.0 m L 0.2 m ol/L的磷酸二氫鉀溶液與 29.1 m L 0.1 m ol/L的
氫氧化鈉溶液混勻后，稀釋到100 mL.
GB/T 18979- 2003
2.2. 15 黃曲霉毒素標準品(黃曲霉毒素BB2,GG):純度)9900
2-2. 16 黃曲霉毒素標準儲備溶液:用苯一乙睛(98+2)溶液分別配制。. 100 mg/mL的黃曲霉毒素B, ,
B2,G,,G:標準儲備液，保存于4℃?zhèn)溆谩?/span>
2.2. 17 黃曲霉毒素混合標準工作液:準確移取適量的黃曲霉毒素BB 2,G G:標準儲備液，用苯一乙
睛(98+2)溶液稀釋成混合標準工作液。
2.2. 18 柱后衍生溶液(0.05%碘溶液):稱取。. 1 g碘，溶解于20 mL甲醇后，加純水定容至200 mL,
以0. 45 jam的尼龍濾膜過濾,4℃避光保存。
2.3 儀器和設備
實 驗 室 常規(guī)儀器、設備及下列各項。
2.3. 1 高速均質器:18 000 r/min-22 000 r/mine
2.3.2 黃曲霉毒素免疫親和柱。
2.3.3 玻璃纖維濾紙:直徑11 cm，孔徑1. 5 pme
2.3.4 玻璃注射器:10 mL,20 mLa
2.3.5 玻璃試管:直徑12 mm，長75 mm，無熒光特性。
2.3.6 液相色譜儀:具有360 nm激發(fā)波長和大于420 nm發(fā)射波長的熒光檢測器。
2.3.7 空氣壓力泵。
2.3.8 微量注射器:100 KLe
2.3.9 色譜柱:C,，柱(柱長150 mm，內徑4.6 mm，填料直徑5 pm) e
2.4 分析步驟
2.4. 1 提取
2.4.1.1 大米、玉米、小麥、花生及其制品:準確稱取經過磨細(粒度小于2 mm)的試樣25. 0 g于
250 mL具塞錐形瓶中，加人5. 0 g氯化鈉及甲醇一水(7+3)至125.0 mL(V,)，以均質器高速攪拌提取
2 min。定量濾紙過濾，準確移取15.0 mL(V2)濾液并加人30.0 mL(V,)水稀釋，用玻璃纖維濾紙過濾
1-2次，至濾液澄清，備用。
2.4.1 .2 植物油脂:準確稱取試樣 25.0 g 于 250m L具塞錐形瓶中，加人 5.0 g 氯化鈉及加人甲醇一水
(7+3)至 125.0m L(V,)，以均質器高速攪拌提取 2m in。定量濾紙過濾，準確移取 15.0 M l-(V2)濾液
并加人30. 0 mL(磯)水稀釋，用玻璃纖維濾紙過濾1-2次，至濾液澄清，備用。
2.4.1.3 醬油:準確稱取試樣 50.0 g 于 250.0 mL具塞錐形瓶中，加人 2.5 g氯化鈉及加人甲醇一水
(8十2)至100.0 mL(V4)，以均質器高速攪拌提取1 mine定量濾紙過濾，準確移取10. 0 mL(V )濾液
并加人40.0 mL(V,)水稀釋，用玻璃纖維濾紙過濾1-2次，至濾液澄清，備用。
2.4.1.4 食醋:準確稱取 5.0 g 樣品，加人 1.0 g 氯化鈉，以pH7.0 磷酸鹽緩沖溶液稀釋至 25.0 m L
(V,),混勻，定量濾紙過濾。取 10.0 nt L(磯)濾液加人 10.0m L(認 )緩沖液，混勻，以玻璃纖維濾紙過
濾1-2次，至濾液澄清，備用。
2.4.2 凈化
2.4.2. 1 大米、玉米、小麥、花生及其制品、植物油脂:將免疫親和柱連接于20. 0 ml玻璃注射器下。
準確移取15.0 mL(V4)樣品提取液注人玻璃注射器中，將空氣壓力泵與玻璃注射器連接，調節(jié)壓力使
溶液以約6 mI./min流速緩慢通過免疫親和柱，直至2 mL-3 mL空氣通過柱體。以10 mL水淋洗柱
子兩次，棄去全部流出液，并使2 mL-3 mL空氣通過柱體。準確加人1.0 mL(V)色譜級甲醇洗脫，流
速為1 mL/min-2 mL/min，收集全部洗脫液于玻璃試管中，供檢測用。
2.4.2.2 醬油:將免疫親和柱連接于 10.0 m L玻璃注射器下。準確移取 10.0 mL(叭)醬油樣品提取
液注人玻璃注射器中，將空氣壓力泵與玻璃注射器連接，調節(jié)壓力使溶液以約6 ml-/min流速緩慢通過
免疫親和柱。用10 mL 0. 1腸的吐溫一20/PBS清洗，再以10 m1_水清洗柱子兩次，棄去全部流出液，并
使2 mL-3 mL空氣通過柱體。準確加人1.0 mL<V)色譜級甲醇洗脫，流速為1 mL/min-2 mL/min,
GB/T 18979-2003
收集全部洗脫液于玻璃試管中，供檢測用。
2.4.2.3 食醋:將免疫親和柱連接于 10.0 m L玻璃注射器下。準確移取 10.0 mL(V,)食醋樣品提取
液注人玻璃注射器中，將空氣壓力泵與玻璃注射器連接，調節(jié)壓力使溶液以約6 ml-/min流速緩慢通過
免疫親和柱，用10 mL 0. 1寫的吐溫-20/PBS溶液清洗，再以10 mL水清洗柱子兩次，棄去全部流出液，
并使2 mL-3 mL空氣通過柱體。準確加入1.0 mL(V)色譜級甲醇洗脫，流速為1 mL/min-
2 mL/min，收集全部洗脫液于玻璃試管中，供檢測用。
2.4.3 測定
2.4.3. 1 液相色譜條件
流 動 相 :甲醇一水(45+55)
流速 : 。 8M L/min
柱 后 衍 生化系統(tǒng)
衍 生 溶 液:。.05%碘溶液
衍 生 溶 液流速:0.2 m L/min
反 應 管 溫度:700C
反 應 時 間:1m in
2.4.3.2 定量
用進 樣 器 吸取100p L黃曲霉毒素混合標準工作液(2.2.17)注人液相色譜儀，在上述色譜條件
下測定標準溶液的響應值(峰高或峰面積)，得到黃曲霉毒素BB2,G,,G:標準溶液液相色譜圖。
參考譜圖見圖1.
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保留時間/min
圖 1 黃 曲 霉 毒 素 B, ,B 2, G G 2 的 標 準 譜 圖
取 樣 品 洗脫液 1.0 m L加人重蒸餾水定容至 2.0 m L，用進樣器吸取 100p L注人液相色譜儀，
在上述色譜條件下測定試樣的響應值(峰高或峰面積)。經過與黃曲霉毒素標準溶液譜圖比較響應值得
到試樣中黃曲霉毒素 B,、 B2 ,G ,和G:的濃度 :。
2.4.4 空白試驗
用 水 代 替試樣，按 2.4.1-2.4.3步驟做空白試驗。
2.4.5 結果計算
樣 品 中 黃曲霉毒素 BB2,G 1或 G:的含量(X,)以微克每千克表示，按式(1)計算:
(c:一ca )·V
W
(1)
GB/T 18979- 2003
其中:
w一署X(v 開3)XV 4 ，....... . 。.·....···. . (2)
式中:
X,— 樣品中黃曲霉毒素B, ,氏,G，或G:的含量，單位為微克每千克伽g/kg);
c,— 試樣中黃曲霉毒素BB,,G，或G:的含量，單位為微克每升(pg/L) ;
‘。— 空白試驗黃曲霉毒素BB2,G，或G:的含量，單位為微克每升(f'g/L );
V— zui終甲醇洗脫液體積，單位為毫升(mL) ;
W— zui終凈化洗脫液所含的試樣質量，單位為克〔9);
，— 試樣稱取的質量的數值，單位為克(g);
V,— 樣品和提取液總體積，單位為毫升(mL) ;
V2 稀釋用樣品濾液體積，單位為毫升(mL) ;
V3 稀釋液體積，單位為毫升(mL) ;
叭通過親和柱的樣品提取液體積，單位為毫升(mL) ,
黃曲霉毒素總量為BB2,G,,G2的濃度之和，即B,+ B2+ G,+ G2,
計算結果表示到小數點后兩位。
免疫親和層析凈化熒光光度法
3.1 方法提要
試 樣 經 過甲醇一水提取，提取液經過濾、稀釋后，濾液經過含有黃曲霉毒素特異抗體的免疫親和層析
凈化，此抗體對黃曲霉毒素 B B2, G G:具有專一性，黃曲霉毒素交聯在層析介質中的抗體上。用水
將免疫親和柱上雜質除去.以甲醇通過免疫親和層析柱洗脫，加人澳溶液衍生，以提高測定靈敏度。洗
脫液通過熒光光度計測定黃曲霉毒素(B,+ 玖+G,十G2)總量。
3.2 試劑和溶液
除非 另 有規(guī)定，僅使用分析純試劑、重蒸餾水
3.2.1 甲醇(CH30H):色譜純。
3.2.2 甲醇一水(7+3):取70 mL甲醇加30 mL水。
3.2.3 甲醉一水(8+2):取80 mL甲醇加20 mL水。
3.2.4 抓化鈉(NaCD,
3.2.5 磷酸氫二鈉(NatH PO,) 。
3.2.6 磷酸二氫鉀(KH2P O,)o
12. 7 氯化鉀(KCl)
3.2.8 澳溶液儲備液(0.0 1%):稱取適量澳，溶于水，配成 0.01%的儲備液，40C避光保存。
3.2.9 澳溶液工作液(0.002寫):取 10m L0 .0 1%的澳溶液加人 40m L水混勻，于棕色瓶中保存?zhèn)溆谩?/span>
需每次使用前配制。
3.2.1 0 二水硫酸奎寧(C,oH z,N zO z·H2SO4，2Hz0),
3.2.1 1 硫酸溶液(0.0 5m ot/L):取 2.8 m L濃硫酸，緩慢加人適量水中，冷卻后定容至 10 00m L.
3.2.12 熒光光度計校準溶液:稱取3.40 g 硫酸奎寧(CzoH z,N ,0 2·HzS04·2H20)用0.0 5m ot/L硫
酸溶液稀釋至100 mL，此溶液熒光光度計讀數相當于20 has/L黃曲霉毒素標準溶液。
3. 3 儀器和設備
實 驗 室 常規(guī)儀器、設備及下列各項。
3.3. 1 熒光光度計。
3.3.2 高諫均質器.18 000 r/min--22 000 r/min
GB/T 18979-2003
3.3.3 黃曲霉毒索免疫親和柱。
3.3.4 玻璃纖維濾紙:直徑11 cm，孔徑1.5 [am.
3.3.5 玻璃注射器:10 mL,20 mI。
3.3.6 玻璃試管:直徑12 mm，長75 mm，無熒光特性。
3.3.7 空氣壓力泵。
3，4 分析步驟
3.4. 1 提取
同 2.4 .1 ,
3.4.2 凈化
同 2. 4. 2,
3.4.3 測定
3.4.3. 1 熒光光度計校準
在 激 發(fā) 波長 360r an，發(fā)射波長450n 條件下，以。.05m ol/L硫酸溶液為空白，調節(jié)熒光光度計的
讀數值為 。.。Fag/L;以熒光光度計校準溶液(3.2.12)調節(jié)熒光光度計的讀數值為 20.0 F ag/L,
3.4.3.2 樣液測定
取上 述 凈 化后的甲醇洗脫液加人1.0 m L0 .0 020 o澳 溶液，混勻，靜置1m in，按3.4.3.1條件進行
操作，于熒光光度計中讀取樣液中黃曲霉毒素(B,+ B2+ G,+ G2)的濃度。(Kg/L)e
3.4.4 空白試驗
用 水 代 替試樣，按 3.4.1--3.4 .3 步驟做空白試驗。
3.4.5 結果計算
樣 品 中 黃曲霉毒素(B,+ B2+ G,+ G2)的含量(X2)以微克每千克表示，按式(3)計算 :
(c:一CD )·V
W
(3 )
其中:
W一V,X V 2
(V2 + V,)
X V, (4)
式中:
X2— 樣品中黃曲霉毒素(B, +殘十G 十G2)含量，單位為微克每千克伽g/kg),
c2— 試樣中黃曲霉毒素(B，十Bz +G,十G )的含量，單位為微克每升(FHB/L) ;
‘。— 空白試驗黃曲霉毒素(B,+ B2+ G,+ G2)的含量，單位為微克每升恤B/L);
V— zui終甲醇洗脫液體積，單位為毫升(mL) ;
W— zui終凈化洗脫液所含的試樣質量，單位為克(9);
。— 試樣稱取的質量的數值，單位為克(9);
V,— 樣品和提取液總體積，單位為毫升(ML) ;
V— 稀釋用樣品濾液體積，單位為毫升(mL) ;
V 稀釋液體積，單位為毫升(mL);
V,— 通過親和柱的樣品提取液體積，單位為毫升(mL) o
計算結果表示到小數點后一位。
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